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Analyse Cellulaire (SNAP-Tag)

Technologie SNAP-tag

Les systèmes de marquage de protéines SNAP-tag et CLIP-tag permettent de lier à une protéine d’intérêt, de façon spécifique et covalente, n’importe quelle molécule ou presque. Cette méthode comporte deux étapes : clonage et expression de la protéine d’intérêt fusionnée avec un SNAP-tag®, puis marquage de la protéine de fusion avec le substrat du SNAP-tag de votre choix. Le SNAP-tag est une petite protéine fondée sur l’O6-alkylguanine-ADN-alkyltransférase (hAGT) humaine, une protéine de réparation de l’ADN.

Les substrats du SNAP-tag sont des colorants, des fluorochromes, la biotine ou des billes couplés aux groupes partants de la guanine ou de la chloropyrimidine via un espaceur benzyle. Lors de la réaction de marquage, le groupe benzyle substitué du substrat se lie au SNAP-tag de manière covalente. Le CLIP-tag™ est une version modifiée du SNAP-tag conçue pour réagir avec la benzylcytosine plutôt que les dérivés de la benzylguanine. L’utilisation en parallèle du SNAP-tag et du CLIP-tag permet le marquage simultané, indépendant et complémentaire de deux protéines dans les mêmes cellules.

Le SNAP-tag ou le CLIP-tag est fusionné avec la protéine d’intérêt. Le marquage a lieu par formation d’une liaison covalente entre l’étiquette et le substrat, avec libération d’une molécule de guanine ou de cytosine.

Flux de travail

Il vous suffit de cloner et d’exprimer une seule fois votre protéine d’intérêt fusionnée avec le SNAP-tag pour pouvoir l’analyser à l’aide de différents substrats.

Marquage fluorescent de cellules COS-7 exprimant une protéine de fusion contenant le SNAP-tag® pour imagerie sur cellules vivantes

Applications

  • Marquage simultané de deux protéines dans des cellules vivantes
  • Études de localisation et de translocation des protéines
  • Analyses pulse-chase
  • Études d’internalisation des récepteurs
  • Marquage sélectif de la surface cellulaire
  • Analyses pull-down
  • Détection de protéines en SDS-PAGE
  • Cytométrie en flux
  • Études de liaison à haut débit en microplaques
  • Analyses d’interactions avec des biocapteurs
  • Études de liaison par FRET
  • Marquage d’une molécule unique
  • Microscopie à super-résolution

SNAP-tag : un outil d’étiquetage polyvalent pour l’étude de la dynamique des protéines et bien plus encore

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Prix Nobel de chimie 2014

Le prix Nobel de chimie 2014 a été décerné à Stefan Hell (Göttingen, Allemagne), qui a utilisé le SNAP-tag dans ses études de microscopie STED :

Cellules U2-OS en microscopie confocale vs STED :
Les cellules surexpriment une protéine de fusion SNAP-Cep41 (une protéine qui se lie aux microtubules), détectée à l’aide de SNAP-Cell® 647SiR.
Lukinavičius G et al. (2013) « A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. » Nat. Chem.5(2) : 132-9.

Comparaison des technologies SNAP-tag®/CLIP-tagTM avec la GFP

Les technologies SNAP-tag/CLIP-tag sont complémentaires à la GFP, mais présentent des avantages par rapport à cette dernière dans plusieurs applications.

Application SNAP-tag/CLIP-tag GFP et autres protéines fluorescentes
Time-resolved fluorescenceFluorescence can be initiated upon addition of label Color is genetically encoded and always expressed. Also, photoactivatable fluorescent proteins require high intensity laser light, which may activate undesired cellular pathways (e.g., apoptosis)
Pulse-chase analysis Labeling of newly synthesized proteins can be turned off using available blocking reagents (e.g., SNAP-Cell® Block) Fluorescence of newly synthesized proteins cannot be quenched to investigate dynamic processes
Ability to change colors A single construct can be used with different dye substrates to label with multiple colors Requires separate cloning and expression for each color
Surface specific labeling Can specifically label subpopulation of target protein expressed on cell surface using non-cell permeable substrates Surface subpopulation cannot be specifically visualized
Visualizing fixed cells Resistant to fixation; strong labelingLabile to fixation; weak labeling
Pull-down studies “Bait” proteins can be covalently captured on BG beads Requires anti-GFP antibody to non-covalently capture “bait” protein, complicating downstream analysis
Live animal imaging Near-IR dyes are available, permitting deep tissue visualization Limited to visible wavelengths

Troubleshooting

 Application

 Problem

 Possible Cause

 Solution

  Cellular Labeling

 No labeling  Fusion protein
not expressed
  1. Verify transfection
  2. Check expression of fusion protein via Western blot or SDS-PAGE with Vista Green label
 Weak labeling  Poor expression and/or insufficient exposure of fusion protein to substrate
  1. Increase substrate concentration
  2. Increase incubation time
 Rapid turnover of fusion protein
  1. Analyze samples immediately or fix cells directly after labeling
  2. Label at lower temperature (4°C or 16°C)
 High background  Non-specific binding of substrates
  1. Reduce substrate concentration and/or incubation time
  2. Allow final wash step to proceed for up to 2 hours
  3. Include fetal calf serum or BSA during labeling
 Signal strongly reduced after short time  Instability of fusion protein
  1. Fix cells
  2. Switch tag from N-terminus to C-terminus or vice versa
 Photobleaching
  1. Add commercially available anti-fade reagent
  2. Reduce illumination time and/or intensity

Labeling in Solution

 Precipitation  Insoluble fusion
  1. Test from pH 5.0 to 10.0
  2. Optimize salt concentration [50 to 250 mM]
  3. Add 0.05 to 0.1% Tween 20
 Weak or no labeling  Exhaustive labeling has not been achieved
  1. Increase incubation time to 2 hrs at 25°C or 24 hrs at 4°C
  2. Reduce the volume of protein solution labeled
  3. Check expression of fusion protein via SDS-PAGE with Vista Green label
 Loss of activity  Instability of fusion protein
  1. Reduce labeling time
  2. Decrease labeling temperature (4°C or 16°C)

Starter Kits

Product NEB#. Plasmid Fluorophore Block Applications Price
SNAP-Cell® Starter Kit E9100S pSNAPf Vector SNAP-Cell® 505, SNAP-Cell® TMR-Star SNAP-Cell® Block – Intracellular labeling – Cell surface labeling in vitro analysis 252 €
SNAP-Surface® Starter Kit E9120S pSNAPf Vector SNAP-Surface® 488, SNAP-Surface® 549 SNAP-Surface™ Block – Cell surface labeling in vitro analysis 252 €
CLIP-Cell™ Starter Kit E9200S pCLIPf Vector CLIP-Cell™ 505, CLIP-Cell™ TMR-Star CLIP-Cell™ Block – Intracellular labeling – Cell surface labeling in vitro analysis 252 €
CLIP-Surface™ Starter Kit E9230S pCLIPf Vector CLIP-Surface™ 488, CLIP-Surface™ 547 CLIP-Cell™ Block – Cell surface labeling in vitro analysis 252 €
ACP-Surface Starter Kit E9300S pACP-tag(m)-2 Vector CoA 488, CoA 547 N/A – Cell surface labeling in vitro analysis 252 €

Publications

STED
Guzmán, C. et al. (2014) « The efficacy of Raf kinase recruitment to the GTPase H-ras depends on H-ras membrane conformer specific nanoclustering » J. Biol. Chem. 289, 9519-9533.
Stagge, F. et al. (2013) « Snap-, CLIP- and Halo-Tag Labelling of Budding Yeast Cells » PLoS One 8(10): e78745.
Lukinavičius, G. et al. (2013) « Selective Chemical Crosslinking Reveals a Cep57-Cep63-Cep152 Centrosomal Complex » Curr. Biol. 23, 265-270.
Lukinavičius, G. et al. (2013) « A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins » Nat. Chem. 5, 132-139.
Pellett P. A. et al. (2011) « Two-color STED microscopy in living cells. » Biomed. Opt. Expr. 2, 2364-2371.
Testa I. et al. (2010) « Multicolor Fluorescence Nanoscopy in Fixed and Living Cells by Exciting Conventional Fluorophores with a Single Wavelength » Biophys. J. 99, 2686-94.
Hein B. et al. (2010) « Stimulated Emission Depletion Nanoscopy of Living Cells Using SNAP-Tag Fusion Proteins. » Biophys. J. 98, 158–163.

STORM
Liu, Z. et al. (2014) « Super-resolution imaging and tracking of protein-protein interactions in sub-diffraction cellular space » Nat. Commun. 5, 4443.
Perkovic, M. et al. (2014) « Correlative Light- and Electron Microscopy with chemical tags » J. Struct. Biol. 186, 205-213.
Carlini, L. et al. (2014) « Reduced Dyes Enhance Single-Molecule Localization Density for Live Superresolution Imaging » ChemPhysChem 15, 750-755.
Sateriale, A. et al. (2013) « SNAP-Tag Technology Optimized for Use in Entamoeba histolytica » PLoS One 8(12), e83997.
Lukinavičius, G. et al. (2013) « A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins » Nat. Chem. 5, 132-139.
Malkusch, S. et al. (2013) « Single-molecule coordinate-based analysis of the morphology of HIV-1 assembly sites with near-molecular spatial resolution » Histochem. Cell Biol. 139, 173-179.
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RLS-SRM
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