Golden Gate Assembly
La méthode Golden Gate, qui permet l’assemblage efficace de fragments d’ADN avec des jonctions invisibles, a vu le jour en 1996, lorsqu’il a été démontré pour la première fois que plusieurs inserts pouvaient être assemblés dans un vecteur par l’action séquentielle ou simultanée d’une enzyme de restriction de type IIS et de l’ADN ligase du phage T4.
- La séquence de l’extrémité saillante générée n’est pas dictée par l’endonucléase de restriction – aucune séquence supplémentaire n’est donc ajoutée.
- Spécifique à chaque fragment, la séquence des extrémités saillantes permet l’assemblage simultané de plusieurs fragments dans le bon ordre.
- Le site de restriction est éliminé du produit ligaturé, ce qui permet de réaliser la digestion et la ligature simultanément.
L’assemblage Golden Gate et les méthodes dérivées exploitent la capacité des endonucléases de restriction de type IIS à cliver l’ADN en dehors de la séquence de reconnaissance. Les inserts et les vecteurs de clonage sont conçus de façon à placer le site de reconnaissance à l’extrémité distale du site de clivage, afin que l’endonucléase de restriction de type IIS puisse éliminer la séquence de reconnaissance de l’assemblage.
Des fragments d’ADN peuvent ainsi être assemblés de manière ordonnée et avec des jonctions invisibles en une seule réaction. La précision de l’assemblage dépend de la longueur des séquences saillantes. Les endonucléases de restriction de type IIS qui créent des extrémités dépassant de 4 bases (telles que BsaI/BsaI-HF®v2, BbsI, BsmBI, Esp3I et PaqCI) sont donc préférables.
Il est nécessaire de concevoir minutieusement les extrémités saillantes pour orienter l’assemblage des inserts et de vérifier l’absence des sites de l’endonucléase de restriction de type IIS au sein des fragments pour obtenir l’assemblage attendu. L’utilisation d’outils en ligne tels que NEB Golden Gate Assembly Tool simplifie considérablement ces deux processus. L’assemblage Golden Gate est une technologie robuste qui permet d’assembler plusieurs fragments d’ADN même en présence d’éléments répétés, avec la possibilité d’introduire des mutations dirigées. Cette méthode a été largement utilisée, entre autres, pour construire des TALEN sur mesure destinées à l’édition génomique in vivo.
Flux de travail Golden Gate
Liste des produits disponibles
| PRODUIT | REF. | COND. | PRIX |
|---|---|---|---|
| NOUVEAU NEBridgeTM Ligase Master Mix | M1100S | 50 rxns |  |
| NOUVEAU NEB Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) | E1602S/L | 20 / 100 rxns | |
| NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF v2) | E1601S/L | 20 / 100 rxns |  |
Plus d’informations disponibles dans la section Ressources Techniques ou sur neb.com
