Monarch HMW DNA Extraction Kits

Monarch HMW DNA Extraction Kits permet d’extraire rapidement et avec fiabilité de l’ADN de haut poids moléculaire (HMW, High Molecular Weight) à partir d’échantillons biologiques. Ces kits utilisent un processus optimisé qui combine une lyse cellulaire délicate avec une génération de fragments de longueur ajustable, suivie de la précipitation de l’ADN extrait à la surface de grandes billes de verre. La taille de l’ADN va de 50-250 kb pour le protocole standard à l’ordre de la Mb pour certains types d’échantillons lorsque les vitesses d’agitation minimales sont utilisées. Avec un rendement élevé, une excellente pureté et une élimination quasi totale de l’ARN, l’ADN purifié est prêt à être utilisé dans les applications en aval, y compris le séquençage à longues lectures.

Comparaison de méthodes d’extraction d’ADN HMW

Protocoles extrêmement rapides et simples utilisant une approche innovante reposant sur des billes de verre :

Principe de l’extraction d’ADN de haut poids moléculaire à l’aide de Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood. Visualisez l’extraction d’ADN HMW à partir de cellules et de sang avec Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood (NEB réf. T3050).

Extraction reproductible d’ADN HMW à partir de cellules et de sang avec Monarch HMW DNA Extraction Kit : 

ADN extrait avec Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood. 1 x 10⁶ cellules HEK293 fraîches et 500 μl de sang humain frais ont été utilisés comme échantillons initiaux pour des préparations réalisées selon les instructions du kit, avec la vitesse d’agitation indiquée au-dessus des pistes du gel. 500 ng d’ADN issu des réplicats ont été résolus par PFGE (gel d’agarose à 1 %, 6 V/cm, 13 °C pendant 20 heures, temps de commutation allant de 0,5 à 94 secondes sur un système BioRad^® CHEF-DR^® III). Le rendement et les rapports de pureté de chacune des préparations sont présentés dans les tableaux correspondants. Lambda PFG Ladder (NEB réf. N0341) a été utilisé comme marqueur de poids moléculaire. 

Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue permet de purifier de l’ADN HMW de qualité à partir de divers types d’échantillons :

ADN génomique HMW extrait avec Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue. 10 mg de rein de rat congelé, 10 mg de foie de souris frais, 20 mg de cerveau de souris congelé, 20 mg de muscle de souris frais, 2 x 10⁹ de cellules d’E. coli congelées, 2 x 10⁸ cellules de B. cereus congelées, 4 mg de X. laevis frais, 3,8 x 10⁸ de cellules de S. cerevisiae fraîches et 15 mg d’A. aegypti congelés ont été utilisés comme échantillons initiaux pour les préparations. Les préparations ont été effectuées selon les instructions du kit avec agitation des échantillons à 2000 rpm. Un flux de travail modifié a été utilisé pour les préparations de S. cerevisiae. 500 ng d’ADN issu de chaque échantillon ont été résolus par PFGE (gel d’agarose à 1 %, 6 V/cm, 13 °C pendant 20 heures, temps de commutation allant de 0,5 à 94 secondes sur un système BioRad CHEF-DR III). Le rendement et les rapports de pureté de chacune des préparations sont présentés dans les tableaux correspondants. Lambda PFG Ladder (NEB réf. N0341) a été utilisé comme marqueur de poids moléculaire.

Monarch HMW DNA Extraction Kit permet de produire de l’ADN de haut poids moléculaire avec d’excellents rendements, pureté et longueur de fragments par rapport à d’autres kits disponibles sur le marché :

De l’ADN HMW a été isolé à partir de 1 × 10⁶ cellules HEK293 et de sang humain frais avec les kits indiqués dans la légende de la figure. Les volumes de sang initial utilisés sont ceux précisés dans les protocoles des fabricants (N : 500 μl, C : 200 μl, R : 500 μl, Q : 200 μl, P : 300 μl, Z : 200 μl).

Les échantillons traités avec Monarch (pistes 1-2) ont été purifiés à la vitesse d’agitation maximale durant la lyse (2000 rpm). La variation de longueur des fragments d’ADN cellulaire obtenus à l’aide des protocoles standards pour Monarch et Circulomics (pistes 1-2 et 3-4 respectivement) résulte des vitesses d’agitation utilisées durant la lyse (Monarch : 2000 rpm, Circulomics : 900 rpm). Toutes les autres données présentées correspondent à des duplicats issus de chaque kit. Les protocoles standards destinés au sang et aux cellules ont été utilisés. Qiagen ne fournit pas de protocole pour les cultures cellulaires ; une version modifiée du protocole pour le sang a été utilisée. Les échantillons ont été élués dans 100 μl, à l’exception de celui traité avec Zymo, qui a été élué dans 50 μl conformément aux recommandations du fournisseur.

Le rendement et la pureté des échantillons standards ont été analysés sur un spectrophotomètre Trinean Dropsense 16 (désormais Lunatic d’Unchained Labs). Les rendements des échantillons de sang indiqués ont été normalisés par 100 μl. La teneur en ARN a été déterminée par analyse HPLC de la teneur en nucléosides après digestion de 1 μg d’ADN élué avec Nucleoside Digestion Mix (NEB réf. M0649). Le traitement facultatif à la RNase a été réalisé avec la préparation Zymo.

L’ADN utilisé pour les banques de séquençage a été extrait en suivant les protocoles standards pour les cultures cellulaires et les échantillons de sang de mammifères frais, sans sélection de taille ultérieure. L’ADN de rein de souris a été extrait à partir d’échantillons frais à l’aide d’un homogénéisateur rotor-stator pour l’homogénéisation des échantillons. Les banques ont été préparées à l’aide de LSK109 Ligation Sequencing Kit et chargées sur une cellule de mesure FLO-MIN106D. Le séquençage a été effectué sur GridION^® Mk1 pendant 48 heures maximum, ou moins si aucune donnée n’a été générée par la cellule de mesure. La cellule de mesure n’a subi aucun traitement supplémentaire (ex. : rinçage). Dans les échantillons ayant généré plus de 10 Go de données, 800–1 000 ng de banque d’ADN ont été chargés sur la cellule de mesure pour des performances de séquençage optimales et une utilisation efficace des pores. Les longueurs de lecture sont exprimées en bases sauf indication contraire.