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Évaluation de résultats de qPCR : représentation des performances dans des diagrammes « dots in boxes »

NEB a développé une méthode pour mieux évaluer la grande quantité de données générées lors d’une qPCR. Le résultat de cette analyse consiste en un diagramme à points, dans lequel les principales caractéristiques d’une qPCR réussie sont représentées par un seul point. Cette méthode d’analyse permet de comparer de nombreuses cibles et conditions dans un seul graphique.

Pour chaque expérience, des réactions en triplicat sont réalisées sur des concentrations de matrice couvrant cinq ordres de grandeur (courbes d’amplification, en bas à gauche). Trois contrôles sans matrice (NTC) sont également effectués, pour un total de 18 réactions par condition/cible. L’efficacité (en %) est calculée (courbe de calibration, en haut à gauche) et représentée graphiquement en fonction de ΔCq (diagramme à points, au centre), qui correspond à la différence entre le Cq moyen de la concentration la plus faible et celui du NTC. Ce paramètre reflète aussi bien la détection de la plus petite concentration que l’amplification non spécifique. Les critères de performance acceptables définis sont une efficacité de 90-110 % et un ΔCq supérieur ou égal à 3 (cadre vert).

D’autres critères de performance sont exprimés sous forme d’un score de qualité sur 5 points (en haut à droite) :

1. 1. Linéarité de l’amplification, indiquée par le coefficient R² de la courbe de calibration
2. 2. Reproductibilité, évaluée par la cohérence des trois valeurs de Cq pour chaque concentration initiale
3. 3. Constance du niveau de fluorescence, reflétée par une intensité finale (RFU_max) similaire
4. 4. Pente de la courbe
5. 5. Forme sigmoïde de la courbe

Le score de qualité est représenté par la taille et le remplissage du point : un point solide situé à l’intérieur du cadre correspond à une expérience répondant à tous les critères de performance. Ce système d’évaluation a été élaboré à partir des lignes directrices MIQE pour la qPCR/RT-qPCR (Bustin, S.A. et al. (2009) Clin Chem. 55, 611-22 et Trombley Hall, A. et al. (2013) PLoS One 8(9):e73845). Un exemple d’analyse est illustré ci-dessous.