Conseils – Transformation Chimique

Décongélation

  • Il est conseillé de décongeler les cellules sur glace.
  • L’ADN doit être ajouté dès la disparition des derniers cristaux de glace.
  • Il est possible de décongeler les cellules entre les mains, mais l’exposition à une température supérieure à 0 °C diminue l’efficacité.

Qualité de l’ADN

  • L’ADN utilisé pour la transformation doit être purifié et repris dans de l’eau ou du tampon TE.
  • Un maximum de 10 µl d’un mélange réactionnel de ligature peut être utilisé, avec une efficacité seulement deux fois plus faible.
  • Afin de maximiser le nombre de transformants, il est recommandé de purifier l’ADN à l’aide d’une colonne à centrifuger ou par extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l’éthanol.

Quantité d’ADN

La quantité d’ADN optimale est inférieure à celle communément admise. Avec le plasmide pUC19 superenroulé purifié, l’efficacité de transformation est maximale pour une quantité comprise entre 100 pg et 1 ng. Cependant, le nombre total de colonies pouvant être obtenues à partir d’une seule réaction de transformation augmente avec l’utilisation de quantités d’ADN allant jusqu’à environ 100 ng .

Effet de la quantité d’ADN utilisée sur l’efficacité de transformation et le nombre de colonies obtenues : La quantité optimale est inférieure à celle communément admise. Avec le plasmide pUC19 superenroulé purifié, l’efficacité de transformation est maximale pour une quantité comprise entre 100 pg et 1 ng. Cependant, le nombre total de colonies pouvant être obtenues à partir d’une seule réaction de transformation augmente avec l’utilisation de quantités d’ADN allant jusqu’à environ 100 ng .

Incubation de l’ADN avec les cellules sur glace

Incuber sur glace pendant 30 minutes. L’efficacité de transformation est divisée par 2 chaque fois que la durée de cette étape est réduite de 10 minutes.

Effet du temps d’incubation de l’ADN sur l’efficacité de transformation des cellules NEB 5-alpha Competent E. coli : 50 μl de cellules compétentes ont été transformés avec 100 pg d’ADN de contrôle pUC19 en suivant le protocole « High Efficiency Transformation Protocol » fourni, en faisant varier le temps d’incubation de l’ADN de 0 à 40 minutes.

Choc thermique

La température et la durée du choc thermique sont spécifiques au volume de transformation et au récipient. En général, une incubation de 30 secondes à 42 °C est recommandée, sauf pour BL21 (NEB réf. C2530) qui nécessite exactement 10 secondes.

Effet de la durée du choc thermique sur l’efficacité de transformation des cellules NEB 5-alpha Competent E. coli : 50 μl de cellules compétentes ont été transformés avec 100 pg d’ADN de contrôle pUC19 selon le protocole « High Efficiency Transformation Protocol » fourni, en faisant varier la durée du choc thermique de 0 à 80 secondes.

Régénération

  • Une incubation à 37 °C pendant 1 heure est optimale pour la régénération des cellules et pour l’expression de la résistance à l’antibiotique.
    L’efficacité de transformation est divisée par 2 chaque fois que la durée de cette étape est réduite de 15 minutes.
  • Le milieu SOC donne une efficacité de transformation 2 fois supérieure par rapport au milieu LB.
  • Une incubation sous agitation ou avec rotation du tube donne une efficacité de transformation 2 fois plus élevée.

Effet du milieu de régénération sur l’efficacité de transformation : 50 μl de NEB 5-alpha Competent E. coli ont été transformés avec 100 pg d’ADN de contrôle pUC19 en suivant le protocole « High Efficiency Transformation Protocol » fourni, en faisant varier le milieu de régénération. Le SOC Outgrowth Medium de NEB offre l’efficacité de transformation la plus élevée.

 

Étalement

  • Les cellules peuvent être étalées sur un milieu sélectif tiède ou froid, humide ou sec, sans effet significatif sur l’efficacité de transformation.
  • L’étalement des cellules sur un milieu tiède et sec est plus facile et permet aux colonies de se former le plus rapidement.

NEB 5-alpha offre une efficacité de transformation élevée : les efficacités de transformation des cellules NEB 5-alpha et DH5α ont été comparées en suivant les protocoles recommandés par leurs fabricants respectifs. Les valeurs indiquées correspondent à la moyenne de résultats obtenus en triplicat.

NEB 5-alpha offre un coût par transformation avantageux. Les calculs ont été effectués sur la base des prix catalogue et des volumes de transformation recommandés.



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