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In vitro RNA Synthesis

Contexte

La synthèse in vitro de molécules d’ARN simple brin est une technique courante essentielle à la recherche sur les ARN, un domaine en plein essor. Flexible, elle permet de produire des transcrits sur mesure et de leur apporter des modifications de manière à les optimiser pour les applications en aval. Bien qu’il existe d’innombrables façons de synthétiser l’ARN, tous les protocoles suivent la même procédure de base.

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Flux de travail détaillé

Préparation de la matrice

La première étape de la synthèse d’ARN in vitro consiste à préparer la matrice d’ADN correspondant à la séquence d’intérêt. Pour une transcription en run-off, la matrice d’ADN plasmidique est généralement linéarisée à l’aide d’une enzyme de restriction. Outre les plasmides, les produits de PCR et les oligonucléotides synthétiques peuvent également servir de matrices pour les réactions de transcription. Nous vous recommandons Q5 High-Fidelity DNA Polymerase si vous envisagez d’utiliser un produit de PCR comme matrice.

Synthèse in vitro

L’ADN matrice est transcrit par l’ARN polymérase des phages T7, T3 ou SP6, en présence de ribonucléosides triphosphates (rNTP). La polymérase parcourt le brin matrice et synthétise un brin d’ARN complémentaire à l’ADN (en utilisant l’uracile à la place de la thymine). L’ARN polymérase se déplace de l’extrémité 3′ vers l’extrémité 5′ de la matrice d’ADN, pour produire une molécule d’ARN dans le sens 5′→3′.

HiScribe™ T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit est conçu pour la production rapide de grandes quantités d’ARN in vitro. La réaction est facile à préparer : il suffit de mélanger le NTP Buffer Mix, le T7 RNA Polymerase Mix et une matrice d’ADN appropriée. Ce kit permet également de synthétiser des ARN coiffés ou colorés en incorporant des analogues de coiffe (ARCA) ou des nucléotides couplés à des colorants. HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit est un système de transcription d’ARN in vitro extrêmement flexible qui utilise l’ARN polymérase T7. Différents types d’ARN peuvent être synthétisés à l’aide de ce kit, notamment avec marquage interne ou ajout cotranscriptionnel d’une coiffe.

Synthèse et modification conjointes d’ARN

Pour la synthèse et la modification conjointes d’ARN, NEB propose HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit et HiScribe™ T7 ARCA mRNA Kit (with tailing).
Ces deux kits contiennent les réactifs nécessaires à la synthèse d’ARN, à sa modification et à sa purification.

Modification d’ARN

Les ARNm synthétisés in vivo par des organismes eucaryotes subissent une modification cotranscriptionnelle, qui consiste en l’ajout d’une coiffe en 5′. Constituée d’un résidu 7-méthylguanosine, cette dernière protège l’ARN transcrit de la digestion par les nucléases et induit l’initiation de la traduction. D’autre part, les ARNm eucaryotes sont polyadénylés en 3′ par une polymérase indépendante de la matrice. La queue poly(A) joue également un rôle dans la stabilité des ARNm et la régulation de la traduction.

Les ARN transcrits in vitro destinés à être introduits dans des cellules par transfection ou micro-injection peuvent être coiffés par les enzymes coiffantes du virus de la vaccine et polyadénylés par la poly(A) polymérase d’E. coli, de façon à imiter les ARNm. Des analogues de coiffe, tels que (m7G(5′)ppp(5′)G), peuvent également être utilisés pour ajouter une coiffe aux ARN durant la transcription.

Les ARN synthétisés peuvent être utilisés dans diverses applications, notamment les études structurelles et fonctionnelles de l’ARN, la biochimie des ribozymes, les tests de protection à la RNase et les transferts d’acides nucléiques (en tant que sondes d’hybridation), les expériences sur les ARN antisens et les ARNi, les biopuces, la micro-injection, la traduction in vitro et les vaccins à ARN.

Veuillez consulter notre RNA Cap Analog Selection Chart (tableau de sélection des analogues de coiffe d’ARN) pour trouver un analogue de coiffe adapté à votre application.

Purification d’ARN

Une fois la transcription in vitro terminée, la matrice peut être dégradée à l’aide de la DNase I, et les ARNm purifiés par affinité avec les Oligo (dT)25 Cellulose Beads.

Plus d’informations disponibles dans la section Ressources Techniques ou sur neb.com