Reverse Transcription / cDNA Synthesis

ProtoScript^® II Reverse Transcriptase

ProtoScript^® II Reverse Transcriptase est une version recombinante de la transcriptase inverse de M-MuLV présentant une activité RNase H réduite et une thermostabilité accrue. Elle peut être utilisée pour synthétiser le premier brin d’ADNc à des températures plus élevées que la M-MuLV Reverse Transcriptase sauvage. Active jusqu’à 48 °C, l’enzyme recombinante offre une meilleure spécificité, un rendement d’ADNc supérieur et davantage d’ADNc complets allant jusqu’à 12 kb.^

La synthèse d’un premier brin d’ADNc a été réalisée à partir d’ARN totaux de cellules Jurkat (1 μg) dans des réactions de 20 μl. Des mélanges réactionnels sans transcriptase inverse ont été incubés à différentes températures pendant 3 minutes. Après l’ajout de 200 unités de SuperScript^® II (A) ou de ProtoScript II Reverse Transcriptase de NEB (B), les réactions ont été incubées aux températures indiquées pendant 50 minutes, puis soumises à une inactivation thermique à 80 °C pendant 5 minutes. Des réactions de PCR de 25 μl ont été effectuées avec 1 μl d’ADNc à l’aide de LongAmp Taq Master Mix sur 35-40 cycles. La piste L correspond au 2 Log DNA Ladder.

Une synthèse d’ADNc robuste, même pour les matrices longues

La synthèse d’un premier brin d’ADNc a été réalisée à partir d’ARN totaux de cellules Jurkat (1 μg) dans des réactions de 20 μl avec 200 unités de ProtoScript II Reverse Transcriptase de NEB. Les réactions ont été incubées à 42 °C pendant 50 minutes, avant d’être soumises à une inactivation thermique à 80 °C pendant 5 minutes. Des réactions de PCR de 25 μl ont été effectuées avec 1 μl d’ADNc à l’aide de LongAmp Taq Master Mix sur 35-40 cycles. La taille des fragments est indiquée au-dessus du gel.

Synthèse d’ADNc de qualité, même à partir de faibles quantités d’ARN

La synthèse d’un premier brin d’ADNc a été réalisée à partir de quantités décroissantes d’ARN totaux de cellules Jurkat (de 1 μg à 1 pg) dans des réactions de 20 μl avec 200 unités de ProtoScript II Reverse Transcriptase de NEB. Les réactions ont été incubées à 42 °C pendant 50 minutes, avant d’être soumises à une inactivation thermique à 80 °C pendant 5 minutes. Des réactions de PCR de 25 μl ont été effectuées avec 1 μl d’ADNc à l’aide de LongAmp Taq Master Mix sur 40 cycles. La cible est un fragment de 0,6 kb de GAPDH. La piste L correspond au 2 Log DNA Ladder.

ProtoScript II Reverse Transcriptase : une sensibilité remarquable

Des quantités décroissantes d’ARNm de luciférase (de 10⁹ à 10² molécules) ont été converties en ADNc en présence de 1 ng d’ARN totaux de cellules Jurkat, avec 50 unités de ProtoScript II Reverse Transcriptase de NEB, dans un volume réactionnel de 20 μl. 1/20 de l’ADNc synthétisé a été amplifié à l’aide de SsoAdvanced™ SYBR^® Green Supermix. La plus faible quantité d’ARNm de luciférase détectée est de 5 molécules.