Enzymes de Modification

Modification de l’ADN

La fragmentation, la nébulisation, la restriction enzymatique ou l’amplification par PCR produisent souvent des échantillons d’ADN dont les extrémités sont incompatibles avec les applications en aval.

Ainsi, l’ADN doit subir un traitement enzymatique sélectif avant la ligature, étape suivante dans le processus de clonage. Celle-ci consiste en la formation de liaisons phosphodiester covalentes entre les groupes 3′-hydroxyle et 5′-phosphate de l’insert et du vecteur. Il existe différents types de modifications des extrémités de l’ADN en vue de la ligature, tels que la production de bouts francs, la phosphorylation et la déphosphorylation. Certaines enzymes sont capables d’éliminer le phosphate en 3′ de façon à exposer un groupe hydroxyle, tout en ajoutant un phosphate en 5′. L’ADN peut être lié à d’autres molécules soit par appariement de bases complémentaires, soit par ligature d’extrémités franches. Il est possible de faire appel à l’action combinée d’enzymes pour enlever les bouts cohésifs issus d’une digestion par une endonucléase de restriction ou ajoutés lors de la PCR.

Ces traitements peuvent également être utilisés pour modifier l’état de phosphorylation de l’extrémité 5′ de l’ADN dans les applications de détection, d’extraction et de séquençage. L’incorporation d’un phosphate radioactif est souvent employée pour le marquage de l’ADN.

Déphosphorylation

Après digestion, l’ADN possède généralement un groupe 5′-phosphate nécessaire à la ligature. Afin d’empêcher le vecteur linéarisé de se refermer sur lui-même, il est généralement conseillé de déphosphoryler son extrémité 5′. Cela vous permet de manipuler l’ADN digéré comme vous le souhaitez avant de procéder à la ligature et facilite la formation de plasmides recombinants.  En effet, la recircularisation du vecteur augmente le bruit de fond du clonage. La déphosphorylation peut être réalisée à l’aide de différentes phosphatases, notamment Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) (NEB réf. M0371), Quick CIP (NEB réf. M0525) et Antarctic Phosphatase (NEB réf. M0289).

Production d’extrémités franches

Elle consiste à éliminer les extrémités saillantes en 3′ ou 5′ pour permettre la ligature de bouts francs.  Il existe plusieurs approches pour ce faire. Les nucléotides terminaux non appariés peuvent être supprimés à l’aide d’une enzyme à activité exonucléase, qui catalyse l’hydrolyse des liaisons phosphodiesters à partir des extrémités, une base à la fois. Pour les fragments d’ADN présentant une extrémité 5′ saillante, il est possible de la rendre franche en comblant l’extrémité 3’ rentrante avec une ADN polymérase en présence de dNTP. L’élimination ou le remplissage des extrémités peuvent être accomplis par différentes enzymes, telles que DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment (NEB réf. M0210), T4 DNA Polymerase (NEB réf. M0203) ou Mung Bean Nuclease (NEB réf. M0250). L’ADN ainsi traité est compatible pour une ligature avec n’importe quel fragment ou vecteur à extrémités franches.

Phosphorylation

Un ADN simple brin ou double brin possédant un groupe hydroxyle en 5′ doit être phosphorylé avant ligature, car un groupe 5′-phosphate est nécessaire à cette réaction. Les extrémités peuvent également être phosphorylées avec des phosphates radioactifs pour marquer l’ADN dans les applications de détection, d’extraction et de séquençage. Différentes polynucléotide kinases, notamment T4 Polynucleotide Kinase (NEB réf. M0201) et T4 Polynucleotide Kinase (3′ phosphatase minus) (NEB réf. M0236), peuvent être utilisées pour transférer le γ-phosphate de l’ATP à l’extrémité 5′ de l’ADN.