CRISPR/Cas9 – Genome Editing

Avec le développement d’outils permettant d’apporter des modifications précises et ciblées au génome de cellules vivantes, l’édition génomique devient réalité. Récemment, une nouvelle technologie reposant sur la CRISPR-associated protein-9 (Cas9) de Streptococcus pyogenes, une nucléase bactérienne, a suscité un réel engouement. Le développement de cette technique fait suite aux diverses tentatives de manipulation fonctionnelle des gènes qui ont été entreprises au fil des années, notamment par recombinaison homologue et ARN interférents. En particulier, les ARNi sont devenus un outil essentiel pour étudier la fonction des gènes à faible coût et à haut débit, mais ils présentent l’inconvénient de n’inhiber l’expression des gènes que de manière temporaire et d’avoir des effets non spécifiques imprévisibles. D’autres approches récentes de modification ciblée du génome – les nucléases à doigts de zinc (ZFN, Zinc Finger Nucleases) et les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN, Transcription Activator-Like Effector Nuclease) – permettent aux chercheurs de générer des mutations en introduisant des coupures double brin pour activer les mécanismes de réparation de l’ADN. Le coût et le temps nécessaires au développement de ces méthodes empêchent toutefois leur démocratisation, notamment pour les études à grande échelle et à haut débit.

Les séquences CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – de courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées – et les gènes associés aux CRISPR (cas) jouent un rôle fondamental dans l’immunité adaptative de certaines bactéries et archées, en assurant la reconnaissance et l’élimination du matériel génétique étranger.

Composé de trois éléments seulement (Cas9, ARNcr et ARNtr), le système de nucléase CRISPR peut, grâce à sa simplicité, être adapté à l’édition génomique. L’ARNcr et l’ARNtr peuvent être combinés en un ARN guide synthétique unique (ARNg) pour obtenir un système à deux composants capable d’effectuer une coupure double brin ciblée. Cette cassure déclenche la réparation de l’ADN, soit par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ, Non-Homologous End Joining), un mécanisme sujet aux erreurs, soit par recombinaison homologue (HDR, Homology Directed Repair). En présence d’une matrice homologue à la séquence cible, la voie HDR est activée, ce qui permet d’introduire des mutations précises. En revanche, en l’absence de matrice, c’est la voie NHEJ qui intervient, produisant des insertions et/ou des délétions (indels) au niveau du locus cible.

Brochure disponible :
« Genome Editing » !

Pour les applications in vitro, NEB propose la Cas9 Nuclease, S. pyogenes sous forme recombinante.

Autres ressources en lignes :

Recueils de plasmides :
http://www.addgene.org

Outils pour CRISPR-gRNA :
http://crispr.mit.edu
http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html

Forums en ligne :
https://groups.google.com/forum/crispr

Ressources Spécifiques aux Organismes :
http://wormcas9hr.weebly.com
http://www.flyrnai.org

Article
“CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing:
A New Era in
Molecular Biology”

Produits disponibles pour la méthode CRISPR/Cas

 

PRODUIT	REF.	COND.	PRIX
Cas9 Nuclease, Streptococcus pyogenes	M0386 S	70 pmol (1µM)
	M0386 M	2000 pmol (20µM)
	M0386 T	400 pmol (20µM)
EnGen Cas9 NLS, Streptococcus pyogenes	M0646 T	400 pmol (20µM)
	M0646 M	2000 pmol (20µM)
EnGen Spy Cas9 Nickase	M0650 S	70 pmol (20µM)
	M0650 T	400 pmol (20µM)
EnGen Spy dCas9 (SNAP-tag)	M0652 S	70 pmol (20µM)
	M0652 T	400 pmol (20µM)
EnGen Lba Cas12a	M0653 S	70 pmol
	M0653 T	2000 pmol
NEW EnGen Sau Cas9	M0654 S	70 pmol
	M0653 T	400 pmol
Sélection de produits NEB utilisables pur du CRISPR :
EnGen sgRNA Synthesis Kit	E3322 S	20 rxns
EnGen Mutation Detection Kit	E3321 S	25 rxns
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	E2040 S	50 rxns
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	E2050 S	50 rxns
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with Tailing)	E2060 S	20 rxns
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit	E2065 S	20 rxns
Q5 Site-directed Mutagenesis Kit (with or without comp. E. coli)	E0554 S	10 rxns (+ comp. E.coli)
	E0552 S	10 rxns
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	M0491 S	100 u
	M0491 L	500 u
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	M0493 S	100 u
	M0493 L	500 u
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	E2621 S	10 rxns
	E2621 L	50 rxns
	E2621 X	250 rxns
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (incl. comp. E. coli)	E5520 S	10 rxns
T7 Endonuclease I	M0302 S	250 u
	M0302 L	1,250 u