Des enzymes conçues pour allier praticité et performance
Depuis plus de 35 ans, New England Biolabs développe des solutions innovantes pour les applications en biologie moléculaire. Leader reconnu des enzymes de restriction, NEB a conçu une gamme d’endonucléases haute fidélité, HF®. Ces enzymes modifiées possèdent la même spécificité que leurs équivalents natifs, tout en présentant les avantages d’une activité star réduite, d’une digestion rapide (en 5-15 minutes) et d’une activité à 100 % dans le CutSmart® Buffer.
Conçues pour des performances exceptionnelles, les enzymes de restriction HF sont pleinement actives dans une multitude de conditions, minimisant la formation de produits aspécifiques tout en offrant une grande flexibilité dans la mise au point du protocole.
Des performances optimales dans un large éventail de conditions
Les enzymes de restriction HF ont été modifiées en remplaçant des résidus d’acides aminés fonctionnels et en sélectionnant les meilleurs mutants avec des performances optimales dans un large éventail de conditions. Avec la gamme HF, vous pouvez utiliser différentes quantités d’enzymes et incuber les réactions pendant 5-15 minutes ou toute la nuit, vous obtiendrez les résultats dont vous avez besoin.
Avantages
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Une activité star réduite qui élimine les clivages non spécifiques |
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Un tampon unique, pour une utilisation pratique sans perte de performance |
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Des enzymes Time-Saver, pour des digestions flexibles allant de 5-15 minutes à toute la nuit |
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Une flexibilité accrue sans coût supplémentaire |
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1 ml de Gel Loading Dye, Purple (6X) inclus |
HF Enzymes disponibles
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« Activité Star »
Dans des conditions réactionnelles non standards, certaines enzymes de restriction sont capables de cliver des séquences similaires – mais non identiques – à leur séquence de reconnaissance définie. Cette modification de la spécificité porte le nom d’« activité star ». Celle-ci constituerait une propriété générale des endonucléases de restriction (1), qui cliveraient toutes à des sites non canoniques dans des conditions extrêmes, dont certaines sont présentées ci-dessous. Le risque d’activité star varie d’une enzyme à l’autre. La grande majorité des enzymes de New England Biolabs ne présentent aucune activité star lorsqu’elles sont utilisées selon les conditions recommandées dans leurs tampons NEBuffer respectifs. Pour les enzymes affichant une telle activité, cette information figure sur la fiche produit correspondante dans le catalogue, sur la fiche technique et sur notre site Web
La manière dont la spécificité est modifiée dépend de l’enzyme et des conditions réactionnelles induisant l’activité star. Dans la plupart des cas, il s’agit de substitutions d’une seule base, de la troncature des bases externes de la séquence de reconnaissance ou d’une coupure simple brin (2). Certaines enzymes montrent une spécificité relâchée vis-à-vis de leur séquence de restriction dans les conditions standards et sont capables de cliver des sites non spécifiques (secondaires) en présence du site primaire (3).
EcoRI-HF® (NEB réf. R3101) ne présente aucune activité star dans les digestions incubées toute une nuit, même à des concentrations plus élevées. Des réactions de 50 μl ont été préparées avec 1 μg d’ADN du phage lambda, la quantité d’enzyme indiquée et le tampon réactionnel recommandé. Les réactions ont été incubées durant la nuit à 37 °C. La piste M correspond au 1 kb DNA Ladder (NEB réf. N3232).
Comment éviter l’ « Activité Star » ?
| Conditions contribuant à l’activité star | Mesures pouvant être prises pour inhiber l’activité star |
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| Concentration en glycérol élevée (> 5 % v/v) | Les enzymes de restriction étant stockées dans 50 % de glycérol, la quantité d’enzyme ajoutée ne doit pas dépasser 10 % du volume réactionnel total. Utiliser le volume réactionnel standard (50 µl) pour réduire l’évaporation durant l’incubation. |
| Rapport concentration d’enzyme / quantité d’ADN élevé (variable selon l’enzyme, généralement 100 unités/µg) | Utiliser la quantité d’enzyme minimale nécessaire pour éviter une digestion excessive et réduire la concentration finale du glycérol dans la réaction. |
| Tampon non optimal | WhenPréparer si possible les réactions dans le tampon recommandé. Les tampons avec une force ionique et un pH différents peuvent contribuer à l’activité star. |
| Temps de réaction prolongé | Utiliser le temps de réaction minimal nécessaire à une digestion complète. Une incubation prolongée peut entraîner une activité star accrue, ainsi que l’évaporation de la réaction. |
| Présence de solvants organiques [DMSO, éthanol (4), éthylène glycol, diméthylacétamide, diméthylformamide, sulphalane (5)] | S’assurer que la réaction est exempte de solvants organiques (tels que les alcools) pouvant être présents dans l’échantillon d’ADN. |
| Substitution du Mg2+ par d’autres cations divalents (Mn2+, Cu2+, Co2+, Zn2+) | Utiliser le Mg2+ comme cation divalent. D’autres cations divalents risquent de ne pas se loger correctement dans le site actif de l’enzyme de restriction et donc d’interférer avec la bonne reconnaissance de la séquence cible. |
Références :
1. Nasri, M. and Thomas, D. (1986) Nucleic Acids Res. 14, 811. PMID: 3003698
2. Barany, F. (1988) Gene 65, 149. PMID: 2842230
3. Bitinaite, J. and Schildkraut, I. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99, 1164-1169. PMID: 11818524
4. Nasri, M. and Thomas, D. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 7677. PMID: 2823216
5. Tikchinenko, T. I. et al. (1978) Gene. 4, 195-212. PMID: 33871
Plus d’informations disponibles dans la section Ressources Techniques ou sur neb.com
