CRISPR/Cas9 – Genome Editing

Avec le développement d’outils permettant d’apporter des modifications précises et ciblées au génome de cellules vivantes, l’édition génomique devient réalité. Récemment, une nouvelle technologie reposant sur la CRISPR-associated protein-9 (Cas9) de Streptococcus pyogenes, une nucléase bactérienne, a suscité un réel engouement. Le développement de cette technique fait suite aux diverses tentatives de manipulation fonctionnelle des gènes qui ont été entreprises au fil des années, notamment par recombinaison homologue et ARN interférents. En particulier, les ARNi sont devenus un outil essentiel pour étudier la fonction des gènes à faible coût et à haut débit, mais ils présentent l’inconvénient de n’inhiber l’expression des gènes que de manière temporaire et d’avoir des effets non spécifiques imprévisibles. D’autres approches récentes de modification ciblée du génome – les nucléases à doigts de zinc (ZFN, Zinc Finger Nucleases) et les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN, Transcription Activator-Like Effector Nuclease) – permettent aux chercheurs de générer des mutations en introduisant des coupures double brin pour activer les mécanismes de réparation de l’ADN. Le coût et le temps nécessaires au développement de ces méthodes empêchent toutefois leur démocratisation, notamment pour les études à grande échelle et à haut débit.

Les séquences CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – de courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées – et les gènes associés aux CRISPR (cas) jouent un rôle fondamental dans l’immunité adaptative de certaines bactéries et archées, en assurant la reconnaissance et l’élimination du matériel génétique étranger.

Composé de trois éléments seulement (Cas9, ARNcr et ARNtr), le système de nucléase CRISPR peut, grâce à sa simplicité, être adapté à l’édition génomique. L’ARNcr et l’ARNtr peuvent être combinés en un ARN guide synthétique unique (ARNg) pour obtenir un système à deux composants capable d’effectuer une coupure double brin ciblée. Cette cassure déclenche la réparation de l’ADN, soit par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ, Non-Homologous End Joining), un mécanisme sujet aux erreurs, soit par recombinaison homologue (HDR, Homology Directed Repair). En présence d’une matrice homologue à la séquence cible, la voie HDR est activée, ce qui permet d’introduire des mutations précises. En revanche, en l’absence de matrice, c’est la voie NHEJ qui intervient, produisant des insertions et/ou des délétions (indels) au niveau du locus cible.

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Pour les applications in vitro, NEB propose la Cas9 Nuclease, S. pyogenes sous forme recombinante.

in vivo Gene Editing in Zebrafish

– NEBs Cas9 in microinjection in customer experiment

„„The experiments with NEB Cas9 are going well, seems very effective with a variety of sgRNAs. The high conc. Cas9 protein (Anm.: #M0386 M) is extremely efficient in vivo!““

James A. Gagnon, Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, USA

cas9_zebrafish

Des mutations dans le gène codant pour la tyrosinase bloquent la pigmentation des mélanocytes chez le poisson-zèbre : 10 ARNg ciblant la tyrosinase et 18 μM de Cas9 de NEB ont été injectés dans des embryons au stade une cellule. Des catégories de pigmentation ont été établies 3 jours après la fécondation. Avec un volume d’injection de 2 nl, plus de 90 % des embryons étaient totalement dépourvus de pigmentation.

Images and data by courtesy of James A. Gagnon, Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, USA

Autres ressources en lignes :

A télécharger

Article
“CRISPR/Cas9 and Targeted Genome Editing:
A New Era in
Molecular Biology”

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Note d’Application
“Protocol for using recombinant Cas9 Nuclease to assess locus modification in genome editing experiments”

Icon_AppNote_LocusModification
Download PDF (0.5 MB)

Note d’Application
“Construction of an sgRNA-Cas9 expression vector via single-stranded DNA oligo bridging of double-stranded DNA fragments”

Icon_AppNote_ConstructionsgRNA
Download PDF (0.4 MB)

Table de produits

Produits disponibles pour la méthode CRISPR/Cas

 

PRODUIT REF. COND. PRIX
Cas9 Nuclease, Streptococcus pyogenes M0386 S 70 pmol (1µM) shop_icon
M0386 M 2000 pmol (20µM)
M0386 T 400 pmol (20µM)
EnGen Cas9 NLS, Streptococcus pyogenes M0646 T 400 pmol (20µM) shop_icon
M0646 M 2000 pmol (20µM)
EnGen Spy Cas9 Nickase M0650 S 70 pmol (20µM) shop_icon
M0650 T 400 pmol (20µM)
EnGen Spy dCas9 (SNAP-tag) M0652 S 70 pmol (20µM) shop_icon
M0652 T 400 pmol (20µM)
EnGen Lba Cas12a M0653 S 70 pmol shop_icon
M0653 T 2000 pmol
NEW EnGen Sau Cas9 M0654 S 70 pmol shop_icon
M0653 T 400 pmol
Sélection de produits NEB utilisables pur du CRISPR :
EnGen sgRNA Synthesis Kit E3322 S 20 rxns shop_icon
EnGen Mutation Detection Kit E3321 S 25 rxns shop_icon
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit E2040 S 50 rxns shop_icon
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit E2050 S 50 rxns shop_icon
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with Tailing) E2060 S 20 rxns shop_icon
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit E2065 S 20 rxns shop_icon
Q5 Site-directed Mutagenesis Kit (with or without comp. E. coli) E0554 S 10 rxns
(+ comp. E.coli)
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E0552 S 10 rxns
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase M0491 S 100 u shop_icon
M0491 L 500 u
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase M0493 S 100 u shop_icon
M0493 L 500 u
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix E2621 S 10 rxns shop_icon
E2621 L 50 rxns
E2621 X 250 rxns
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit
(incl. comp. E. coli)
E5520 S 10 rxns shop_icon
T7 Endonuclease I M0302 S 250 u shop_icon
M0302 L 1,250 u

Plus d’informations disponibles dans la section Ressources Techniques ou sur neb.com